一、污染來源

　　細胞培養過程中污染的來源主要有以下幾條途徑：

　　1、不潔的動物組織標本

　　很多動物組織本該是無菌的（直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統除外），但由于取材時不小心也會有污染的機會。組織本身含有細菌，如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會帶菌，造成細胞污染。

　　2、空氣

　　空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺使用過久，濾板未定期更換或長久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時不帶口罩或外界氣流過強，污染空氣進入操作區，也會導致污染。春夏季南方地區多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。

　　3、清洗消毒

　　培養用物品、材料洗刷不凈，培養用液和器材滅菌不*也會引入微生物和有毒物質。

　　4、操作

　　來自操作者的污染主要有以下幾方面：

　　（1）器材和溶液使用前未仔細檢查是否污染過，或者是否已經消毒滅菌處理過，或者雖經處理，時隔已久又末重新處理。

　　（2）操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細菌和支原體。

　　（3）培養瓶口未用75%酒精擦和燒灼。

　　（4）操作者不當心，動作不正確而將吸管或無菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。

　　（5）操作者操作時大聲說話，來回走動揚起灰塵等。

　　5、血清

　　市售血清滅菌不*，潛在病毒和支原體污染。

　　二、污染的鑒別

　　1、細菌、真菌污染的檢測

　　（1）肉眼觀察細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內可明顯觀察到。如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

　　（2）鏡下觀察在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

　　（3）接種觀察采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有污染。

　　2、支原體污染的檢測

　　（1）相差顯微鏡觀察將細胞接種于事先放置于培養瓶內的支持物（一般用長形蓋玻片），24小時后用清潔塵鑷子從培養瓶中取出支持物，細胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養法，直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。

　　（2）低漲處理地衣紅染色觀察取已在培養瓶中的支持物蓋片或培養液，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細胞。用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。用培養液時，先吸取1mL，500～800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL，將0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定，離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3張涂片。然后用2%醋酸依地紅（地衣紅2g，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL）染5分鐘。純酒精過三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹膠中。若染色過深，可先用75%酒精脫色，再封片。鏡下觀察見支原體呈暗紫色小點，位于細胞外或細胞之間。

　　（3）熒光染色法觀察用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養法將細胞接種在蓋片上，在細胞匯合前（即未長滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258（生理鹽水配制）中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細胞面滴加數滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細胞培養液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。

　　（4）電鏡檢測若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行。需經過固定、包埋、切片后才能進行觀察。詳細方法同細胞形態觀察法（見第九章）。

　　（5）培養檢測將2.5×109/L細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基（Sigma或北京生物制品所生產的均可），培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。細胞培養污染