用辣根過氧化物酶標記的試劑進行間接檢測的實驗步驟

（1）將蓋玻片、載玻片或培養板置于水平面上；如為1h或1h以下的短程孵育，則勿需濕孵，可將蓋玻片或載玻片直接放置在實驗臺上。多個蓋玻片則需置于Parafilm膜上，因為Parafilm膜有彈性，能夠防止抗體溢出蓋玻片邊緣，也便于鑷子操作。但如果圓形蓋玻片數量過多，將其置于細胞生長與固定的24孔培養板中。
如果孵育時間>1h，則需將其置于培養皿或濕盒中以利濕孵。有幾種方法可供放置蓋玻片或載玻片選用，以便于操作和濕孵，可依具體情況選用。例如，在培養皿上鋪一層水飽和的濾紙，再將載玻片置于濾紙上。蓋玻片亦可經類似處理。如用24孔培養板，則需在板蓋上鋪一層潮濕的濾紙來保持濕度。
如孵育時間超過1h，可將抗體溶液加在Parafilm膜上的玻片上，再將蓋玻片或載玻片（樣品面朝-F）蓋在抗體溶液上。孵育完畢后用PBS洗滌。 用辣根過氧化物酶標記的試劑進行間接檢測的實驗步驟

左為用蓋玻片在石蠟膜上操作右為在24孔板中操作
（2）加入一抗：加入足夠量的一抗使其覆蓋細胞，但不要溢出蓋玻片或載玻片邊緣，通常加入iotA。所有稀釋液必須用蛋白質溶液配置，如3％BSA／PBS；
單克隆抗體通常為組織培養上清液（特異性抗體濃度為20～50ug／m1，未稀釋）。腹水、純化的單克隆和多克隆抗體以及粗制的多克隆血清應該進行稀釋度測定。如果特異性抗體的濃度是未知的，應測試初始樣品的不同稀釋度（1：10，1：100，1：1 000，1：10 000）。
（3）蓋玻片、載玻片或平皿的孵育，在室溫下至少30 min。超過30 min則需濕孵或采用步驟（1）所述的方法。對于某些反應，將孵育時間延長至12h，能夠提高實驗的靈敏度；
（4）PBS洗3次，每次5min以上；用辣根過氧化物酶標記的試劑進行間接檢測的實驗步驟
PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以幫助解決背景問題。
（5）加入HRP標記的抗Ig抗體。這些試劑應購于有良好信譽的商業試劑公司。確認所選擇的二抗是特異性針對一抗的種屬來源。例如，一抗如果來源于兔，則羊抗兔Ig將是一個很好的選擇。二抗應該用含蛋白質的溶液（如3％BSA／PBS）進行稀釋。供應商會建議合適的稀釋度，但如果沒有相關建議，可進行二抗稀釋度測定，稀釋度范圍在1：10和1：1 000之間。
加入稀釋液的競爭蛋白必須為非特異性抗體，其來源應與標記二抗一致，即同一種屬的動物。例如，如果使用標記的羊抗兔Ig，則稀釋液中須含1％的非免疫羊18（從非免疫動物中分離及純化）。
（6）加入標記的二級試劑后在室溫下孵育至少20min，但不應超過1h；
（7）用PBS洗3次，每次5min以上。
（8）zui后一次洗滌時，準備底物DAB。將6mgDAB溶于10ml 0．5mol／LTris緩沖液中（pH 7．6），加lml 0．3％W／V的氯化鎳儲存液（或等量的氯化鈷）；
加0．1ml的3％H202溶液。30％H202溶液較易獲得，可置4℃保存1個月；
如出現沉淀，用Whatman 1#濾紙（或類似濾紙）過濾；
（9）將底物溶液加入樣品。觀察樣品，在背景發生變化前出現適量黑色沉淀時終止反應。常為1～20min之間。在水中漂洗數次即可終止反應
（10）加入DPX，用光學顯微鏡觀察結果。